rstool 是使用 python 编写的重测序流程软件,当前版本为 v1.6。主要功能如下：
- index （参考基因组建立索引）
- data_filter (下机数据过滤)
- bwa （bwa比对）
- realign （比对过滤，GATK 局部重新比对）
- snpcall (GATK + freebayes + bcftools 变异检测)
- cnvcall (cnvcaller 变异检测)
- svcall （breakdancer + lumpy + manta 变异检测）
- vcf_marge（3种snp变异检测结果整合）
- sv_merge （3种sv变异检测结果整合）
- vcf_stat （对变异文件进行基本的统计）
- 使用 cutadapt 和 sickle 进行接头处理和数据质控 cutadapt 是处理数据接头最常使用的软件。sickle 是数据质控中较为准确的软件，内部使用滑动窗口式过滤方法，适应于如今测序数据。
- 使用 bcftools 和 freebayes 同时进行 snp calling 除了 GATK 之外，最常用的变异检测软件就是这两个，我们使用 2 个软件同时 snp calling 再取 snp 位点交集，之后还可以与 GATK 软件结果取 snp位点交集。这样处理的结果很大可能会一刀切减少 snp 位点数据，可以根据实际情况和测序方法的差别，改变过滤条件。位点数据应在十万到百万级别。
- vcf 文件的聚合 使用 bcftools 取位点交集。
- cnvcaller 是研究群体 cnv 较为方便的软件。使用去 PCR 重复的 bam 文件进行 cnv 检测。
- 由于结构变异检测软件众多，且不同软件对结构变异检测的灵敏度不同，所以我们选择 breakdancer + lumpy + manta 这样的检查组合，当各个软件独立运行完成后，根据3个软件的结构变异起始位置的 overlap 进行sv的合并。变异检测我们只挑选 del(删除)、dup（重复）、inv（倒位），breakdancer只能给出 del 和 inv，manta 只能给出 del 和 dup。
- 详细的命令说明
- 子命令方法，各个命令间基本独立
- 自动识别染色体号
- 生成流程脚本
- python源码加二进制文件（无需python和流程所需扩展包）
- 可扩展的功能
一：数据过滤
./rstool_v1.6.4 data_filter -l raw_data.list -a CACTCGACTAGCATCA参数解释：
-l 下机数据文件表 raw_data.list 格式如下：
testa /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testa_1.fq.gz /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testa_2.fq.gz
testb /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testb_1.fq.gz /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testb_2.fq.gz
testc /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testc_1.fq.gz /zfssz3/NASCT_BACKUP/MS_PMO2017/testc_2.fq.gz
-a 3'接头序列. 当不提供接头序列时，则不使用 cutadapt 去除接头。
二：建立参考基因组索引
rstool_v1.6.4 index -r genome.fa参数解释：
-r 参考基因组文件
三：bwa 比对
rstool_v1.6.4 bwa -r 02.Index/genome.fa -l 01.Data_filter/clean_list.txt参数解释：
-r 在建立参考基因组索引时会默认建立源参考基因组的软链，在比对时需要已经建立好的文件，所以 -r 请使用软链文件。
-l 数据过滤中默认生成clean data 的文件列表，请使用过滤数据的文件列表。
如果想加快比对速度,建议使用bwa-mem2.可在软件列表（contig.ini）进行替换路径。
四：局部重新比对
rstool_v1.6.4 realign -d 03.Bwa/chrbam -rd 02.Index/genome_cut/参数解释：
-d bwa 比对后，分割染色体比对文件的路径
-rd 参考基因组分割染色体路径
五：SNP 变异检测
rstool_v1.6.4 snpcall -r 02.Index/genome_cut -l 04.Realign -i F参数解释：
-r 参考基因组分割染色体后路径（一般变异结果要求按染色体分割）
-l 所有染色体 bam文件列表所在路径
-i 使用 beagle 进行基因组填补（F不填补，T填补）
六：SNP 整合
rstool_v1.6.4 vcf_marge -a freebayes.vcf -b bcftools.vcf参数解释：
-a 由 freebayes 检测的变异文件
-b 由 bcftools 检测的变异文件
七：CNV 变异检测
rstool_v1.6.4 cnvcall -r 02.Index/genome.fa -l 03.Bwa/dup.bam.list参数解释：
-r 参考基因组文件
-l 经过去 PCR 重复的 bam 文件列表。（需要自己对第三步bwa文件夹中去PCR重复的文件做一个list，cnvcaller 不推荐对 bam 文件进行过滤）
八：SV 变异检测
rstool_v1.6.4 svcall -r 02.Index/genome.fa -l 03.Bwa/dup.bam.list参数解释：
-r 参考基因组文件
-l 经过去 PCR 重复的 bam 文件列表。（需要自己对第三步bwa文件夹中去PCR重复的文件做一个list.）
九：SV 整合
rstool_v1.6.4 sv_merge -b breakdancer.ctx -m manta.vcf -s smoove.vcf -c 0.8参数解释： -c 在 sv 整合中 3 种方法 sv 片段的 overlap 占每一种方法结果的百分比。0.8为默认值。
- 流程使用中，各个文件、目录尽量使用绝对路径。
- 现在 GATK 变异检测可以在一个自动处理染色体问题，只需输入参考基因组按染色体分割文件路径即可。
- 在变异整合时，同时只能处理 2 个文件，如果还想整合 GATK 的结果，按脚本替换成 GATK 文件即可。
- 变异过滤条件较为严格，建议样本数大于 100 使用此流程。
- 流程软件使用集群稳定版本，如需替换可在 配置文件（config.ini）下替换。