- 琼脂糖凝胶的制备
- 浓度：琼脂糖（Agarose）浓度在 1%～2%
- 体积：
- 小格：1×TAE 40 mL，Agarose 0.4～0.8 g
- 中格：1×TAE 60 mL，Agarose 0.6～1.2 g
- 大格：1×TAE 80 mL，Agarose 0.8～1.6 g
- 取小锥形瓶洗净，加入上述 TAE、Agarose，微波炉加热 2～4 min。
- 稍微冷却后取出，按 1: 20000 加入核酸染料（GoldView） ，即 40 mL 加入 2 μL 核酸染料，60 mL 3 μL，80 mL 4 μL。
- 槽中放入塑料模具，将凝胶倒入模具中，插上梳子。
- 核酸电泳** **
- 孔位于负极（黑色）一侧。
- 每孔上样 10 μL，marker 用 5～6 μL 即可。
- 120 V， 30 min。
步骤：（以小鼠尾为例）
- 小鼠尾 + 50 μL Buffer L + 1 μL 蛋白酶 K
- 55 ℃ 30 min
- 95 ℃ 5 min
- 离心 > 10000 g，1 min，得到裂解产物作为模版进行 PCR 实验。
- 注意 ：裂解后的鼠尾仍可继续用此法裂解。
- PCR 20 μL 体系：
- 每孔 10 μL mix，1 μL primer，8 μL ddH2O，1 μL template。
- mix：YEASEN® 2× Hieff™️ PCR Master Mix（with Dye）
目的 鉴定已完成的转化的感受态细胞是否带有目的基因。 步骤
- 从固体 LB 培养基挑单克隆菌落接种于 1 mL 液体 LB 培养基，并加入 1 μL 抗生素。接种 6 个 EP 管。37℃ 培养箱摇菌过夜。
- 次日，根据 EP 管中菌液的浑浊程度初步判断菌落生存数量。以此菌液为 PCR 模板做 PCR，20 μL 体系。每管含有
| 2× GC buffer | 10 μL |
|---|---|
| dNTP | 1.6 μL |
| Primer F/R | 0.4 + 0.4 |
| Enzyme | 0.2 μL |
| ddH2O | 6.4 μ |
| Template | 1 μ |
- 将除模板外的液体混合成 mix，并留出适当冗余，即需要做 6 孔的 PCR，按照 7 孔的量进行配制。每管先加入 mix 再加模版。
- PCR 仪程序设定
| 95℃ | 5 min |
|---|---|
| 98 ℃ | 10 s |
| 60 ℃ | 10 s |
| 72 ℃ | 1 min 转至第 2 步 34× |
| 72 ℃ |
-
min |
-
每管 20 μL 体系，加入 5 μL 5× loading buffer 稀释至 1×。
-
注意：与鼠尾鉴定相比，菌液鉴定观察到的条带极强，因细菌含有的核酸成分较组织简单。此现象与细菌和组织蛋白 western blot 类似。
试剂：TRIzol（4℃），氯仿，异丙醇，DEPC水，75%乙醇 步骤：贴壁细胞
- 培养皿弃去培养基，至于冰上，用预冷的PBS洗两遍，弃去PBS。
- 加入1mL TRIzol至培养皿中，吹下皿中的所有细胞。此含有TRIzol的溶液可以-80℃长期保存。
- 移液至EP管中，吹打混匀，室温静置10 min。
- 加入200μL氯仿（⅕ TRIzol），左右摇晃15 sec，液体变为草莓奶昔样，室温静置3min。
- 离心，4℃，12000g，15min。此时液体分三层，中间层最薄。
- 将上层水相转移至新的EP管中，沿侧壁加入等体积的异丙醇，约500μL，上下颠倒混匀6～10次，室温静置10min。
- 离心，4℃，12000g，10min。铰链向外。可见RNA沉淀。
- 弃去上清，注意不要吸到沉淀，可直接倒掉。
- 加入1mL 75%乙醇，上下颠倒数次，离心，4 ℃，7500 g，5 min。再加入1mL 75% 乙醇，相同条件再离心一次。
- 弃去上清，开盖倒扣于吸水纸上，静置使残液充分挥发，亦可正置于通风橱中通风。
- 加入DEPC水30～50μL溶解RNA，上下吹打或vortex 5～10 sec，收集。
- 用Nanadrop测浓度，一般为3～15 μg/μL，A260/A280 在1.8～2.0范围内。
（以六孔板为例）
- 六孔板吸除培养基，用 PBS 洗两遍，吸除 PBS。注意从培养皿壁加液，不要把细胞从培养皿底吹掉。
- 冰上，1 mL Triton X-100（或RIPA裂解液） 和 10 μL 蛋白酶抑制剂（如PMSF，或磷酸酶抑制剂）混匀。
- 六孔板每孔加 150 μL，冰上静置30min ~ 1h。
- 用 200 μL 枪头的底座刮下贴壁细胞，得到悬浊液。
- 离心 4℃，14000 rpm，10 min。此时蛋白存在于上清中。
- 取等量上清置于另一套 EP 管，加入 5× SDS 稀释至 1×，95℃ 煮样 8 min。
- 六孔板吸除培养基，用 PBS 洗两遍，吸除 PBS。注意从培养皿壁加液，不要把细胞从培养皿底吹掉。
- 每孔加入热的 2× SDS μL。
- 弯折 200 μL 枪头，刮下细胞，得到粘稠液体，收集至 EP 管。若不立即超声可冻存。
- 超声破碎机设置为 30% 功率 ，开 3 s 停 2 s。每个 EP 管处理 5 个循环。此时管内液体不再粘稠，即为制得的蛋白样品。
**用途：**从培养基上清中提取蛋白 原理：三氯乙酸为酸性化合物，是阴离子型沉淀剂，在低于蛋白质等电点的PH值时，酸根与带正点荷的蛋白质形成不溶性盐而沉淀。作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团， 使之聚集沉淀。 步骤（以 10 cm 皿为例）
- 吸掉皿中的培养基，用 PBS 洗 3 遍，加无血清培养基 3.5 ml，培养 2～4 h，根据细胞状态调整培养时间。
- 收集培养基，离心，弃去细胞沉淀，加 TCA 至终浓度为 20%，冰上放置 30 min。
- 最高转速离心 10 min，弃上清。
- 用 500 μL 丙酮重悬，最高转速离心 10 min，弃上清。
- 重复上步。
- 自然风干。
- 2× SDS buffer 重悬得到蛋白样品，95 ℃ 煮样 8 min。
制胶： 梯度胶的制备方法：两块 1.5 mm 玻璃板，7 ml 18% 和 10 ml 6% 的两种胶，先各加 1 ml 18%，再用 1 ml 6% 和剩余的 5 ml 18% 混匀。再用混匀后的胶各加 1 ml，再用 1 ml 6% 混匀……依此做法直至 18% 全部用完。然后用 6% 补至所需要的高度即可。 电泳：
- 电泳液直接用蒸馏水稀释即可。
- 样品从冰箱取出后应 55 ℃ 加热数分钟，上样前应充分震荡。
- 恒压 80 V，待 Marker 跑开后可调电压至 120 V。若为了防止条带松散弯曲也可用 80 V 跑完全程。
- 夹板之间的水位过低会导致条带移动变慢（此时电流只有个位数），暂停电泳打开盖子加满电泳液即可。
转膜：
- 转膜前 20 min 剪膜，大小为 5×8 ～ 5.5×8.5 cm²。准备好转膜盘和转膜夹、滤纸，黑胶白膜。
- PVDF 膜使用前需要用甲醇激活 3～5 s，但在甲醇中放置数分钟亦可。
- 转膜过程中需保持整个装置在冰浴中进行。
- 恒流 250 mA ，120 min。
转膜液的稀释：
- 10×→1×：10× 转膜液 100 ml + 甲醇 200 ml + 蒸馏水 700 ml。
- 5×→1×：5× 转膜液 200 ml 加入甲醇 200 ml，再加入蒸馏水定容至 1L。
- 2.5×→1×：2.5× 转膜液 400 ml + 甲醇 200 ml + 蒸馏水 400 ml。
- 注意：实际操作时避免向转膜液中加入甲醇后结晶，应先向转膜液中加入蒸馏水再加入甲醇。
**封闭、洗膜、孵一抗： **
- 转膜完成后用 PBST 冲洗，弃去 PBST，加封闭液置于摇床上封闭 15 min～1 h。封闭液可用 PBST 稀释的5％ 脱脂牛奶或 3％ BSA。
- 封闭完成后回收 BSA，用 PBST 摇床上洗膜三次，每次 5 min。若用脱脂牛奶封闭则不用回收。
- 孵一抗置于 4 ℃ 冰箱摇床过夜，或至少 2 h。为节省抗体可将两张膜放在一个洗膜盒中，采用背对背孵育方式。
**孵二抗、曝光： **
- 回收一抗，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5 min。孵二抗 1 h，弃去二抗。再用 PBST 洗膜 3 次。
- 取荧光液 A 液和 B 液（注意更换枪头）各 1 ml 于 15 ml 离心管中，混匀后避光保存，尽快使用。一张膜用 1 ml 混合液即可。
胃癌细胞系MGC803、BGC823、MKN45、HGC27、SGC7901，正常胃上皮细胞系GES-1均用RPMI-1640培养。 胃癌细胞系KATO-3、腹膜间皮细胞系HMrSV5用IMDM培养基。 完全培养基=空白培养基+10%胎牛血清+1%双抗（青霉素和链霉素）。
| 培养器皿 | 面积（cm2） | 培养液量（ml） | 细胞量 |
|---|---|---|---|
| 96 孔培养板 | 0.32 | 0.1 | 105 |
| 24孔培养板 | 2 | 1.0 | 5×105 |
| 12孔培养板 | 4.5 | 2.0 | 106 |
| 6孔培养板 | 9.6 | 2.5 | 2.5×106 |
| 3.5 cm 培养皿 | 8 | 3.0 | 2×106 |
| 6 cm 培养皿 | 21 | 5.0 | 5.2×106 |
| 10 cm 培养皿 | 55 | 10.0 | 13.7×106 |
| 25cm2 培养瓶 | 25 | 5.0 | 5×106 |
| 75cm2 培养瓶 | 75 | 15～30 | 2×107 |
试剂
- 若大提质粒则制备液体 LB 培养基分装于锥形瓶，每瓶 200 mL，高压灭菌；若小提质粒则满足每个离心管装有 7 mL 的量。
- 若挑选单克隆则需要制备 LB 平板。
- 抗生素一般为氨苄西林或卡那霉素。
步骤
- 从 -80 ℃ 冰箱取出感受态细胞（100 μL 分装于 EP 管），按照质粒名标记，瞬离。
- 2 μL 质粒加入至 100 μL 感受态细胞中，混匀。
- 冰浴 30 min。水浴锅 42 ℃ 预热。（若不挑选单克隆则水浴加热抗生素使其融化）
- 热激，42 ℃， 90 s。
- 冰浴静止 2 min。
不挑选单克隆
- 全部加入至 200 mL LB 培养基中，并按 1:1000 的比例加入抗生素，即加入 200 μL 氨苄西林或卡那霉素。
- 置于 37℃ 恒温振荡培养箱摇菌过夜，至少 16 h。
挑选单克隆
- 每个 EP 管加入 1 mL LB 培养基，置于 37℃ 摇床 1 h。
- 离心 400 g 3 min，吸除部分上清，用剩余的上清液重悬，目的在于浓缩菌液。
- 按照抗性需求选择固体 LB 平板，每板加 50 μL 摇菌后的液体和十余粒玻璃珠，在前后方向和左右方向上快速移动，持续数分钟，使菌液均匀涂布于平板上；也可用弯折的 200 μL 枪头涂板。
- 回收玻璃珠，待平板内液滴干燥后倒置于 37℃ 细菌培养箱过夜。
- 第二天，用小枪头蘸取单独一个菌落接种到 200 mL 液体 LB 培养基中，轻轻吹打，保证全部接种。注意：一个锥形瓶仅接种一个菌落，枪头不能碰到其它菌落。
- 按 1:1000 的比例加入抗生素，即加入 200 μL 氨苄西林或卡那霉素。
- 置于 37℃ 恒温振荡培养箱摇菌过夜，至少 16 h。
注意：上述使用 200 mL LB 培养基适合后接大提质粒，若后接小提质粒则使用 15 mL 离心管加入 7 mL LB 培养基摇菌。
转染 293T
- 转染前 1 d，胰酶消化 293T 细胞，取适量细胞接种到 2 个培养皿中，使其在转染时细胞密度为 70～90%。
- 计算：
- 质粒用量：10 cm 的培养皿可用 10～20 μg，六孔板每孔使用 2 μg。质粒浓度单位为 ng/μL，操作前应计算好质粒的体积（μL）。
- PEI 用量：质粒用量的三倍（数值上），即质粒使用 10 μg，PEI 使用 30 μL。
- Gibco® Opti-MEM 用量：10 cm 的培养皿使用 1 mL，六孔板每孔使用 200 μL。
- 取 EP 管加入上述 3 种试剂，震荡，瞬离，静置 15 min。
- 沿培养皿壁加入到皿中，轻轻混匀，记录时间点。
- 大皿 4～6 h 后换液，六孔板无时间要求。过程中不要用 PBS 洗。
- 转染完成后，理论上应收获部分细胞做 PCR 及核酸电泳验证转染成功，但实际上有时荧光很强，肉眼可直接观察到。
转染肿瘤细胞
- 质粒、Lipo2000 和 Opti-MEM 的用量均同上。
- 质粒加入一半 Opti-MEM，静置 5 min；Lipo2000 加入另一半 Opti-MEM，静置 5 min。
- 上述两者混合，静置 15 min。
- ……
- 转染前一天将细胞铺于六孔板，细胞密度以转染当天约 50% 为宜。
- 收 293T 转染后 24～48 h 的培养基，离心 500 g 5 min，弃去沉淀。
- 上清用 0.45 μm 滤器过滤，用新的离心管收集。
- 吸除六孔板的培养基，将过滤后的培养基沿壁加入，每孔 2 mL。
- 按 1:1000 加入 8 μg/μL Polybrene，即每孔加入 2 μL，记录时间点。
- 4 h 后每孔补充等量培养基 2 mL。
- 转染 24 h 后，换成 2 mL 新的培养基。
- 转染 48 h 后，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率；对于携带嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因的病毒，加入适量嘌呤霉素，筛选稳定转导的细胞株。
原理 对实验结果产生影响的变量：细胞数量，培养时长。 实验步骤
- 6 μL/Vial 分装的 Matrigel 胶用冷的无血清培养基以 1:50 稀释，即每管加入 300 μL 培养基。
- 吹打混匀，在每个小室内加入 130 μL 稀释后的 Matrigel 胶，小室置于 24 孔板中，轻拍 24 孔板边缘，确保铺满小室底部。
- 置于 37℃ 等待 2 h 使胶凝固。
- 在此期间，消化待实验细胞，离心后用培养基重悬，进行细胞计数。
- 2 h 后，取出 24 孔板，吸除小室中残留的培养基，此时小室中仅有已经凝固的 Matrigel 胶。
- 下室加 600 μL 有血清培养基，上室加待实验细胞，细胞数为 1×10^5 个，体积不超过200 μL。
- 37℃ 培养 24～48 h 后从细胞培养箱取出，记录培养时长。
- 用 PBS 洗 3 次：在下室加 800 μL PBS，上室加 200 μL PBS，轻拍 24 孔板边缘。
- 用 4% 多聚甲醛固定侵袭滤膜的细胞：在下室加 800 μL 多聚甲醛，上室加 200 μL 多聚甲醛，室温静置 20 min。
- PBS 洗 3 次。
- 结晶紫染色：在下室加 800 μL 结晶紫染液，上室加 200 μL 结晶紫染液。室温避光静置 1 h，亦可室温避光静置过夜。
- PBS 洗 3 次。
- 用蘸有 PBS 的棉签擦去未侵袭滤膜的细胞。
- 显微镜下计数侵袭细胞数并拍照。
注意事项 Matrigel 使用前应从 -20℃ 转移到 4℃ 待其自然融化，如 4℃ 放置 2 h 或过夜放置。为避免反复冻融，可分装为 6 μL/Vial。
原理 分泌蛋白是指在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，如唾液淀粉酶、胃蛋白酶等。体外培养细胞时分泌蛋白即存在于培养基中。因此，为研究分泌蛋白对细胞侵袭能力的影响，应使用含有和不含有该蛋白的培养基来培养待实验细胞。 步骤
- 两皿 293T 细胞分别转染空质粒和目的基因质粒。
- 吸除培养基，用 PBS 洗两次，吸除 PBS 后加入 3 mL 无血清 DMEM 培养基饥饿培养 4 h。
- 4 h 后吸取培养基 500 g 离心 3 min，弃去沉淀。
- 消化、离心待实验细胞后用此上清重悬，计数后加到已经铺 Matrigel 胶的 Transwell 小室中。
- 37℃ 培养数小时后，固定、染色、观察。
- 细胞铺 96 孔板。每孔加入 CCK8 10 μL，2 h 后每孔吸出 100 μL 置于新孔，注意不能产生气泡。测 450 nm OD 值。若蒸发过多导致剩余液体不足 100 μL，可取 50 μL 测 OD 值再乘 2。
- 对比：OV 和 OV-NC，另需测 5 个不含细胞的孔；时间上按照 0 h、24 h、48 h、72 h 进行实验。
- 细胞消化后充分吹打，制成单个细胞悬液。
- 吸出10μL充入细胞计数板中，可根据需要进行稀释后吸10μL充入计数板中。
- 计数四角大方格内细胞总数。
- 每毫升细胞数（单个细胞悬液）=总数/4*10^4。若稀释则再乘稀释倍数。合理的计数结果为200~500/mm²。
目的 研究细胞与细胞间的粘附能力，通常探究肿瘤细胞与间质细胞间的粘附能力。 原理 有两种细胞粘附试验，分别为细胞与基质、细胞与细胞，此法为细胞与细胞间的粘附试验。 钙黄绿素AM（Calcein AM）是一种活细胞染料，本身无荧光。进入活细胞后被酯酶切去AM基团产生Calcein，产生绿色荧光且短时间内不能排出细胞，达到对活细胞染色的效果。 步骤
- 根据实验计划，预先将间质细胞铺板。
- 用PBS或无血清的培养基稀释Calcein AM至终浓度2～5μM，终体积为96孔板每孔100μL，6孔板每孔1mL，大皿每皿6mL。
- 待染色细胞吸除培养基上清，PBS洗两遍，加入稀释后的Calcein AM染料，避光孵育30min～45min。此时Calcein AM被吸收至细胞内。
- 孵育完成后，吸除上清液，用PBS洗一遍，加入适当完全培养基继续培养30min。此时Calcein AM被酯酶水解。
- 吸除上清液，PBS洗一遍，用胰酶消化细胞，收集，离心。用培养基重悬后进行细胞计数，取最大数量细胞接种至已铺板的间质细胞皿中。培养基一般选用被染色细胞的培养基；若1640与DMEM则选1640，因DMEM含有高糖可能对细胞造成损伤。
- 3h后，吸除培养基上清，PBS洗三遍，荧光显微镜观察。
注意
- 细胞被Calcein AM染色后不可固定。
- 若用共聚焦显微镜拍照则需使用专门的玻璃底皿，参考_外泌体染色与外泌体侵染试验_。
- 细胞接种 10 cm 皿培养至 90% 密度。
- PBS 洗两遍，换无血清培养基 8 mL。
- 24 h 观察细胞，若状态差则收培养基，若状态良好则 48 h 收培养基。
- 培养基上清离心 300 g，10 min，沉淀为活细胞。
- 弃去沉淀，上清离心 2000 g，10 min，沉淀为死细胞。
- 弃去沉淀，上清离心 10000 g，30 min，沉淀为细胞碎片。
- 弃去沉淀，上清离心 100000 g，70 min，沉淀为外泌体和蛋白污染物。
- 用 PBS 重悬，离心 100000 g，70 min，沉淀为外泌体。
- 细胞接种 10 cm 皿培养至 90% 密度。
- PBS 洗两遍，换无血清培养基 8 mL。
- 24 h 观察细胞，若状态差则收培养基，若状态良好则 48 h 收培养基。
- 培养基上清离心 300 g，10 min，4 ℃，沉淀为活细胞。
- 弃去沉淀，上清离心 2000 g，10 min，4 ℃，沉淀为死细胞。
- 用0.22 μm滤器过滤，滤掉细胞碎片和大颗粒。滤液可置于-4℃或-80℃冰箱保存以备后用。
- 超速离心，35000 rpm或210000 g，70 min，4 ℃。转子为SW41Ti。
- 弃去上清，沉淀通常肉眼不可见。加入少量滤后PBS重悬，涡旋2-3 s混匀。
- 离心70 min，同步骤 7，倒掉上清，用残留在管中的PBS重悬并涡旋混匀。
器材：Amicon-100K超滤管，水平转子低温离心机，35mm玻璃底皿（可观察区域20mm），共聚焦显微镜，摇床 试剂：Sigma PKH67染料试剂盒，碧云天Hoechst 33342染料，碧云天抗荧光淬片封片液，滤后PBS，无外泌体的培养基 步骤：
- 染色前一天，消化待侵染细胞，计数，接种到共聚焦显微镜专用的35mm玻璃底皿中，每皿约8000-10000个细胞，1.5 mL培养基。可根据细胞生长特性调整接种数量，最多可接种50000/皿。
- 染色当天：提好的外泌体用100K超滤管离心，水平转子，4℃，4000 g，5 min。（若用水平转子则为5000 g，10-20 min，滤器的两个平面分别朝上和朝下。）150μL原液大约可浓缩为20μL。
- 取10μL（根据外泌体浓度调整）浓缩后的外泌体加入新的EP管中，再加入125μL（根据外泌体浓度调整） Diluent C。另取1个EP管加入0.5μL PKH67染料和125μL Diluent C。两者各自充分混匀。
- 混合上述两个EP管，充分混匀，冰上孵育1-5 min。
注意：必须先分别用Diluent C稀释外泌体和染料，再将两者混合，否则将导致染色不均匀。
- 去除未结合的染液：100K超滤管离心，水平转子，4℃，4000 g，5 min。得到约20μL浓缩液。
- 孵育：根据试验设计用少量（如500μL或1mL）non-exo PBS稀释浓缩液，即为已染好的外泌体；事先铺在玻璃底皿中的细胞吸除培养基，用non-exo PBS洗两遍，再加入1.5 mL non-exo 培养基。加入上述浓缩液，混匀，置于细胞培养箱培养6 h。
- 固定：non-exo PBS洗3次，每皿加入500μL多聚甲醛，10-20 min后吸除，并用PBS洗去多聚甲醛。
- 染核：将Hoechst染液用non-exo PBS稀释到1×，每皿加入少量染液，覆盖住皿底细胞即可。室温静置3-5 min。
- 抗淬灭：吸除Hoechst染液，用non-exo PBS摇床洗2-3次，每次3-5分钟。用1mL枪头滴两滴抗荧光淬灭封片液。
- 共聚焦显微镜观察：PKH67最大激发波长490 nm，最大发射波长502 nm。Hoechst 33342最大激发波长346 nm，最大发射波长460 nm。